比色法：计算浓度并评估数据
了解比色法如何利用校准关系把吸光度与浓度连结起来，并运用稀释计算及可靠的数据判读来求出未知浓度。
淡蓝色溶液和深蓝色溶液含有相同的有色物质。哪一种浓度较高？
你大概会选较深色的那一种，而这通常是正确的起点。光路中有更多有色粒子，表示光在到达侦测器之前会有更多被吸收。但你的眼睛并不是良好的测量仪器。眼睛会适应亮度、难以分辨细微差异，也无法把「深了一点」转化为可靠的浓度数值。
比色法解决了这个问题。它把颜色强度转化为数值测量结果，再利用已知浓度的溶液求出未知样品的浓度。
01从颜色到浓度
想像把光照射穿过两个装有有色溶液、完全相同的容器。
在较稀的溶液中，光路上的吸光粒子相对较少，因此有更多光可以穿过。
在较浓的溶液中，相同体积内有更多吸光粒子。更多光被吸收，因此到达侦测器的光较少。
一个有用的初步模型，是把吸光粒子想像成站在门口前的人。门口几乎没有人时，大部分人都能通过。要是门口挤满了刚听说外面有免费香肠卷的学生，那么能顺利通过的人就少得多。
在这个比喻中：
- 门口代表光穿过溶液的光路
- 人群代表吸光粒子
- 尝试穿过的人代表入射光
这个类比有其限制。分子并不是像微小的墙壁一样实际阻挡光线。它们是透过电子的相互作用，吸收特定波长的电磁辐射。不过，人群模型正确表达了重要关系：吸光粒子越多，通常代表透射光越少。
02比色计实际测量甚么？
比色计让选定波长的光穿过样品，并测量有多少光能够透射出来。
常用的两个相关量是：
- 透射率，描述入射光中有多少比例能穿过样品
- 吸光度，描述样品吸收光的程度
若 \(I_0\) 是进入样品的光强度，而 \(I\) 是离开样品的光强度，则透射率 \(T\) 为
\[ T = \frac{I}{I_0} \]
吸光度 \(A\) 与透射率的关系为
\[ A = -\log_{10}(T) \]
因此，如果有一半的光穿过，\(T = 0.50\)，则
\[ A = -\log_{10}(0.50) = 0.301 \]
吸光度越高，表示溶液吸收了越大比例的所选波长光线。
为甚么不直接使用百分比透射率？
因为吸光度与浓度之间具有特别有用的关系。
在适当条件下，Beer-Lambert 关系式为
\[ A = \varepsilon lc \]
其中：
- \(A\) 是吸光度，没有单位
- \(\varepsilon\) 是摩尔吸光系数，通常以 \(\mathrm{L\,mol^{-1}\,cm^{-1}}\) 表示
- \(l\) 是光穿过溶液的光程长度，通常以 \(\mathrm{cm}\) 表示
- \(c\) 是浓度，通常以 \(\mathrm{mol\,L^{-1}}\) 表示
对于固定的物质、波长和比色皿，\(\varepsilon\) 和 \(l\) 都保持不变。因此
\[ A \propto c \]
所以，在此方法的有效范围内，浓度加倍时，吸光度也应约为原来的两倍。
正是这种线性关系，使比色法适合用于定量分析。
03为甚么要使用校准曲线？
你可能会想，只量度未知样品一次，然后直接把它的吸光度代入 \(A = \varepsilon lc\)。
有时候确实可以这样做。不过，在 HSC 类型的实验分析中，你通常会利用一组已知浓度的标准溶液来求浓度。
假设你配制了数种已知浓度的铜(II)溶液，并量度它们的吸光度：
| 浓度（\(\mathrm{mol\,L^{-1}}\)） | 吸光度 |
|---|---|
| 0.020 | 0.12 |
| 0.040 | 0.24 |
| 0.060 | 0.36 |
| 0.080 | 0.48 |
| 0.100 | 0.60 |
在纵轴绘出吸光度，在横轴绘出浓度。
斜率为
\[ \frac{0.60-0.12}{0.100-0.020} = 6.0\ \mathrm{L\,mol^{-1}} \]
因此校准关系为
\[ A = 6.0c \]
所以，一个吸光度为 \(0.42\) 的未知溶液，其浓度为
\[ c = \frac{A}{6.0} = \frac{0.42}{6.0} = 0.070\ \mathrm{mol\,L^{-1}} \]
重要概念不只是「从图上读数」。标准溶液建立了这套特定测量系统对已知浓度的反应关系，再把未知样品与这个由实验建立的关系作比较。
04选择合适的波长
假设你的溶液呈蓝色。你应该用哪种光照射它：蓝光还是橙红光？
常见的第一个猜测是蓝光，因为溶液本身是蓝色。但这正好把颜色所提供的资讯理解反了。
溶液看起来呈蓝色，是因为与它所吸收的波长相比，蓝色波长更强地透射到你的眼睛。为了更容易侦测浓度差异，比色计应使用该物种能强烈吸收的波长。
对蓝色溶液而言，这通常是互补色的橙红光区域。
这样能提高灵敏度。浓度的小幅变化便能产生较大的、可测量的吸光度变化。
实际最佳波长取决于该物种的吸收光谱，因此「总是使用互补色」只是一个有用的近似原则，而不是普遍适用的规则。更准确地说，通常应选择接近吸收峰值的波长，因为在该处吸光度较高，而且会随浓度明显改变。
05空白样品：量度溶质，而不是容器
比色计并不知道哪些吸收来自你真正关心的化学物质。
比色皿本身可能会吸收或散射部分光线。溶剂也可能吸收一些光。其他试剂也可能有所贡献。
空白样品包含除被测分析物以外的所有成分。利用空白样品调整仪器，可把这些背景效应纳入考虑。
例如，如果你的有色分析物溶解在水中，而且没有其他会吸光的试剂，空白样品就可以只含相同的水，并装在相同类型的比色皿中。
因此，「使用空的比色计」并不是适当的空白校正程序。你要扣除的是样品环境所造成的光学效应，而不是把整个样品环境移除。
06例题：利用校准方程求未知浓度
一名学生得到以下校准关系：
\[ A = 4.80c + 0.010 \]
其中 \(A\) 是吸光度，\(c\) 是以 \(\mathrm{mol\,L^{-1}}\) 表示的浓度。一个未知溶液的吸光度为 \(0.394\)。求它的浓度。
步骤 1
量得的吸光度 \(A\) 与浓度 \(c\) 有关。我们知道 \(A = 0.394\)，因此代入此数值。
\[ 0.394 = 4.80c + 0.010 \]
步骤 2
\[ 0.394 - 0.010 = 4.80c \]
\[ 0.384 = 4.80c \]
步骤 3
\[ c = \frac{0.384}{4.80} = 0.0800\ \mathrm{mol\,L^{-1}} \]
因此未知溶液的浓度为
\[ \boxed{c = 8.00\times10^{-2}\ \mathrm{mol\,L^{-1}}} \]
这个很小但非零的截距，表示实验所得的校准线并没有完全通过原点。这可能源于仪器背景、空白校正不完全，或一般的实验不确定度。你应使用实际量得的校准关系，而不是在没有说明的情况下强迫直线通过原点。
07稀释很重要
比色法通常给你的是实际放入比色皿中的溶液浓度。这个浓度未必等于原始样品的浓度。
假设一个环境水样浓度太高，超出了校准范围。你先把它稀释，再量度稀释后的溶液，却忘了最后把稀释因素还原。
你的比色法计算可以完全正确，但最终答案仍然可能错误。
对于稀释，
\[ c_1V_1 = c_2V_2 \]
其中：
- \(c_1\) 是原始浓度
- \(V_1\) 是从原始溶液取出的体积
- \(c_2\) 是稀释后的浓度
- \(V_2\) 是稀释后的最终体积
例题：求稀释前的浓度
取 10.0 mL 样品并稀释至 50.0 mL。稀释后溶液的吸光度为 \(0.328\)。其校准关系为
\[ A = 3.20c + 0.008 \]
其中 \(c\) 的单位是 \(\mathrm{mmol\,L^{-1}}\)。求原始样品的浓度。
步骤 1
\[ 0.328 = 3.20c + 0.008 \]
\[ 0.320 = 3.20c \]
\[ c = 0.100\ \mathrm{mmol\,L^{-1}} \]
所以，比色计中的溶液浓度为 \(0.100\ \mathrm{mmol\,L^{-1}}\)。
步骤 2
使用
\[ c_1V_1 = c_2V_2 \]
\[ c_1(10.0\ \mathrm{mL}) = (0.100\ \mathrm{mmol\,L^{-1}})(50.0\ \mathrm{mL}) \]
\[ c_1 = 0.500\ \mathrm{mmol\,L^{-1}} \]
因此，原始样品的浓度为
\[ \boxed{0.500\ \mathrm{mmol\,L^{-1}}} \]
五倍稀释会使浓度降至原来的五分之一。因此，最终答案必须是稀释后样品量得浓度的五倍。
08内插比外推更可靠
假设你的标准溶液涵盖 \(0.020\) 至 \(0.100\ \mathrm{mol\,L^{-1}}\) 的浓度范围，但未知样品的吸光度对应于 \(0.160\ \mathrm{mol\,L^{-1}}\)。
你可以直接把直线延伸出去吗？
数学上可以。实验上则有风险。
在已量度的标准值之间使用校准关系，称为内插。在已量度范围之外使用它，称为外推。
问题在于，在较高浓度下，线性关系可能不再可靠。此外，当只有很少光到达侦测器时，仪器的反应也可能变得较不可靠。
更好的做法通常是把未知样品稀释，直到它的吸光度落在校准范围内，再重新量度，最后把稀释因素计算回去。
这种习惯在更广泛的化学监测中同样重要：只有在取得数值的方法本身有效时，数值结果才有意义。当分析结果被用来作出环境决策时，这点尤其重要，详见 环境化学监测：从结果到决策。
09当校准图不像预期那样表现
教科书中的理想校准图是一条直线。真实数据未必如此。
考虑以下结果：
| 浓度（\(\mathrm{mg\,L^{-1}}\)） | 吸光度 |
|---|---|
| 2.0 | 0.11 |
| 4.0 | 0.22 |
| 6.0 | 0.33 |
| 8.0 | 0.44 |
| 10.0 | 0.46 |
前四个数据点显示出清楚的线性趋势。第五个数据点则不是。
较薄弱的回答会是：「10.0 mg L\(^{-1}\) 的结果是错的。」
这样的判断过于肯定。数据显示它与趋势不一致，但单凭这些数据并不能证明原因。
可能的解释包括：
- 该标准溶液配制错误
- 污染
- 比色皿上有指纹或液滴
- 比色皿每次放置方向不一致
- 光路中有气泡
- 仪器限制
- 在较高浓度下偏离线性行为
下一步应采取甚么实验措施，要视乎怀疑的原因而定。重复量度可以帮助区分随机读数问题和可重现的效应。重新配制标准溶液则可以检验是否溶液本身配制错误。
10最容易出现的误解：颜色越深，浓度就按比例越高
如果一种溶液看起来比另一种深两倍，它的浓度是否也是两倍？
不一定。
人眼对颜色深浅的感知并不是定量的吸光度刻度。即使使用仪器，简单的线性关系也只在适当的实验条件下成立。
较稳妥的推理方式是：
- 颜色告诉你正在发生光吸收
- 比色计把透射光转化为测量值
- 标准溶液建立吸光度与浓度之间的关系
- 未知样品最好落在已校准的线性范围内
因此，「颜色较深代表浓度较高」可以作为定性判断。「颜色深两倍就代表浓度是两倍」则不是有效的测量规则。
11评估比色法数据
HSC 题目通常不只要求计算浓度。你也可能需要判断结果是否可信。
分析比色法实验时，一个有用的方法是把问题分成四个方面：
| 问题 | 应检查甚么 |
|---|---|
| 关系是否合适？ | 在所使用的范围内，标准溶液是否显示近似线性的校准关系？ |
| 未知样品是否位于该范围内？ | 优先使用内插，而不是外推 |
| 变量是否受到控制？ | 使用相同的波长、比色皿光程长度、溶剂条件和测量程序 |
| 结果是否可重现？ | 重复读数应该相当一致 |
准确度与精密度也有所不同。
精密度是指重复测量结果彼此有多接近。
准确度是指结果与公认值或真值有多接近。
一组吸光度数据可以非常集中，因此具有高精密度，但同时全部受到相同的系统误差影响而发生偏移。例如，配制不当的空白样品可能使所有读数都向同一方向偏差。
因此，重复量度并不会自动消除系统误差。
12如果比色皿改变了会怎样？
Beer-Lambert 关系式包含光程长度：
\[ A = \varepsilon lc \]
假设浓度完全不变，但光在溶液中行进的距离变成原来的两倍。
会发生甚么？
如果 Beer-Lambert 关系适用，吸光度会加倍，因为 \(l\) 加倍了。
这就是为甚么标准溶液和未知样品应使用相同的比色皿几何条件来量度。校准曲线并不只取决于「该化学物质」。它也取决于建立这条曲线时所使用的测量条件。
13问题与解答
问题 1
某有色离子的校准关系为
\[ A = 5.00c \]
其中 \(c\) 的单位为 \(\mathrm{mol\,L^{-1}}\)。一个未知溶液的吸光度为 \(0.350\)。
计算其浓度。
解答 1
浓度为 \(0.0700\ \mathrm{mol\,L^{-1}}\)。
校准关系直接连结吸光度和浓度：
\[ A = 5.00c \]
代入 \(A = 0.350\)：
\[ 0.350 = 5.00c \]
\[ c = \frac{0.350}{5.00} = 0.0700\ \mathrm{mol\,L^{-1}} \]
因此，
\[ \boxed{c = 7.00\times10^{-2}\ \mathrm{mol\,L^{-1}}} \]
常见错误是把 \(0.350\) 乘以 \(5.00\)。斜率告诉我们每单位浓度会产生多少吸光度，因此要以吸光度除以斜率来求浓度。
问题 2
一名学生配制了以下校准标准溶液。
| 浓度（\(\mathrm{mg\,L^{-1}}\)） | 吸光度 |
|---|---|
| 1.0 | 0.080 |
| 2.0 | 0.159 |
| 3.0 | 0.241 |
| 4.0 | 0.320 |
一个未知样品的吸光度为 \(0.280\)。
估算其浓度，并解释为甚么这个估算比使用同一条校准线来处理吸光度为 \(0.700\) 的未知样品更可靠。
解答 2
第一个未知样品的浓度约为 \(3.5\ \mathrm{mg\,L^{-1}}\)，而这个估算较可靠，因为它是在已校准范围内以内插法求得。
这些数据非常接近以下关系：
\[ A \approx 0.080c \]
其中 \(c\) 的单位为 \(\mathrm{mg\,L^{-1}}\)。
当 \(A = 0.280\)：
\[ c = \frac{0.280}{0.080} = 3.5\ \mathrm{mg\,L^{-1}} \]
所以，
\[ \boxed{c \approx 3.5\ \mathrm{mg\,L^{-1}}} \]
这个数值位于 \(3.0\) 和 \(4.0\ \mathrm{mg\,L^{-1}}\) 的标准溶液之间，因此属于内插。
吸光度 \(0.700\) 则会对应于
\[ c = \frac{0.700}{0.080} = 8.75\ \mathrm{mg\,L^{-1}} \]
但校准数据只延伸至 \(4.0\ \mathrm{mg\,L^{-1}}\)。因此，在 \(8.75\ \mathrm{mg\,L^{-1}}\) 使用这条直线属于外推。
很容易让人误以为两个计算都使用同一条方程，所以同样有效。问题不在代数，而在实验：标准溶液只证明了所量度范围内的线性行为。吸光度为 \(0.700\) 的未知样品最好先稀释，再在该范围内重新量度。
问题 3
取 5.00 mL 未知溶液，稀释至 25.00 mL。稀释后的溶液测得吸光度 \(0.410\)。
校准关系为
\[ A = 2.00c + 0.010 \]
其中 \(c\) 的单位为 \(\mathrm{mmol\,L^{-1}}\)。
计算原始溶液的浓度。
解答 3
原始浓度为 \(1.00\ \mathrm{mmol\,L^{-1}}\)。
先求稀释后溶液的浓度：
\[ 0.410 = 2.00c + 0.010 \]
\[ 0.400 = 2.00c \]
\[ c = 0.200\ \mathrm{mmol\,L^{-1}} \]
现在使用稀释关系
\[ c_1V_1 = c_2V_2 \]
其中：
- \(c_1\) = 原始浓度
- \(V_1 = 5.00\ \mathrm{mL}\)
- \(c_2 = 0.200\ \mathrm{mmol\,L^{-1}}\)
- \(V_2 = 25.00\ \mathrm{mL}\)
\[ c_1(5.00) = (0.200)(25.00) \]
\[ c_1 = 1.00\ \mathrm{mmol\,L^{-1}} \]
因此，
\[ \boxed{c_1 = 1.00\ \mathrm{mmol\,L^{-1}}} \]
很容易出现的错误是把 \(0.200\ \mathrm{mmol\,L^{-1}}\) 当成答案。那只是稀释后的浓度。由于原来的 5.00 mL 被稀释至 25.00 mL，其浓度减少了五倍。
问题 4
一名学生配制了五种相同有色配合物的标准溶液，并各量度一次。
| 浓度（\(\mathrm{\mu mol\,L^{-1}}\)） | 吸光度 |
|---|---|
| 10 | 0.102 |
| 20 | 0.201 |
| 30 | 0.301 |
| 40 | 0.399 |
| 50 | 0.356 |
学生说：
「\(50\ \mathrm{\mu mol\,L^{-1}}\) 的数据点一定是离群值，所以我要删除它，只使用前四个数据点。」
评估这个决定，并描述一个更有力的实验处理方法。
解答 4
学生不应自动删除 \(50\ \mathrm{\mu mol\,L^{-1}}\) 的结果。它明显与趋势不一致，但单次测量不足以确定原因。
前四个标准溶液大约符合
\[ A \approx 0.0100c \]
其中 \(c\) 的单位为 \(\mathrm{\mu mol\,L^{-1}}\)。如果这个关系继续成立，在 \(50\ \mathrm{\mu mol\,L^{-1}}\) 时预期的吸光度约为
\[ A \approx (0.0100)(50) = 0.500 \]
因此，量得的数值 \(0.356\) 明显低于预期。
怀疑出现问题是合理的，但仍有多种可能解释。\(50\ \mathrm{\mu mol\,L^{-1}}\) 的溶液可能配制错误，比色皿中可能有气泡或污染，仪器可能产生错误读数，或者该系统可能真的开始偏离线性行为。
更有力的处理方法是重复量度，并且最好重新配制一份 \(50\ \mathrm{\mu mol\,L^{-1}}\) 的标准溶液。也可以在范围的较高浓度部分加入更多标准溶液，以测试校准曲线是否开始弯曲。
很容易出现的做法，是把「不符合直线」直接等同于「不良数据」。这其实假设了直线模型在 \(50\ \mathrm{\mu mol\,L^{-1}}\) 时已确定正确。但校准实验本身的一部分目的，正是在检验这个假设。
如果重复量度并正确配制的高浓度标准溶液仍持续低于线性预测，那么适当的结论就是：线性校准范围在到达该浓度之前已经结束。
问题 5
某实验室使用 \(0\) 至 \(8.0\ \mathrm{mg\,L^{-1}}\) 的标准溶液，得到一条直线校准关系
\[ A = 0.100c \]
其中 \(c\) 的单位为 \(\mathrm{mg\,L^{-1}}\)。
一个未知样品最初测得 \(A = 1.20\)。由于这高于校准范围，一名学生取 10.0 mL 未知样品稀释至 20.0 mL。
稀释后样品测得 \(A = 0.58\)。
另一名学生认为：
「第一次读数预测浓度为 \(12.0\ \mathrm{mg\,L^{-1}}\)。经过两倍稀释后，吸光度应该正好是 \(0.60\)。我们量得 \(0.58\)，所以稀释一定不准确。」
这个结论是否合理？求出此实验所支持的最佳浓度估计，并解释推理过程。
解答 5
不合理。最有力的估计是原始样品浓度为 \(11.6\ \mathrm{mg\,L^{-1}}\)，这是根据稀释后的量度所得，而 \(0.60\) 与 \(0.58\) 之间的差异本身并不能证明稀释不准确。
原始吸光度为 \(1.20\)。如果把校准方程延伸至已建立范围之外，
\[ 1.20 = 0.100c \]
会得到
\[ c = 12.0\ \mathrm{mg\,L^{-1}} \]
然而，标准溶液只延伸至 \(8.0\ \mathrm{mg\,L^{-1}}\)，其对应的最大已校准吸光度为
\[ A = (0.100)(8.0) = 0.80 \]
因此，原始读数 \(1.20\) 位于已验证的校准范围之外。\(12.0\ \mathrm{mg\,L^{-1}}\) 是外推结果，而不是有充分测量依据的浓度。
现在使用位于校准范围内的稀释后读数：
\[ 0.58 = 0.100c_{\text{稀释后}} \]
\[ c_{\text{稀释后}} = 5.8\ \mathrm{mg\,L^{-1}} \]
样品由 10.0 mL 稀释至 20.0 mL，所以稀释倍数为
\[ \frac{20.0}{10.0}=2.00 \]
因此，
\[ c_{\text{原始}} = (5.8\ \mathrm{mg\,L^{-1}})(2.00) = 11.6\ \mathrm{mg\,L^{-1}} \]
所以，
\[ \boxed{c_{\text{原始}} = 11.6\ \mathrm{mg\,L^{-1}}} \]
这里较隐晦的陷阱，是把外推得到的 \(12.0\ \mathrm{mg\,L^{-1}}\) 当成基准，再用它来判断稀释后的结果。这颠倒了两次量度在证据上的可靠程度。
\(0.58\) 的读数是在已建立的校准范围内取得，因此是较有力的证据。原始的 \(1.20\) 读数告诉我们样品对现有校准而言浓度过高，但并不能证明它的浓度恰好是 \(12.0\ \mathrm{mg\,L^{-1}}\)。
如果线性关系碰巧在校准范围以外仍完全成立，那么理想的两倍稀释确实会得到 \(A = 0.60\)。但这项实验并未证实这个假设。\(0.60\) 与 \(0.58\) 之间的差异可能来自一般测量不确定度、稀释不确定度，或原始高吸光度区域中的非线性行为。
关键原则是：一个计算在数学上可以非常整齐，却仍可能建立在缺乏实验支持的假设上。
14比色法之后的延伸
比色法提供了一个在 HSC Chemistry 中反复出现的通用分析模式：
已知标准溶液 → 测量讯号 → 校准关系 → 未知浓度 → 评估可靠性
仪器可能不同，但推理方式仍然适用。你需要知道实际量度的是甚么、校准关系是否适用于未知样品，以及样品在量度前的处理是否改变了其浓度。
在学习其他定量方法时，区分「量得的讯号」与「你真正想知道的化学量」同样十分有用。例如，沉淀滴定：计算未知浓度 使用的是完全不同的实验讯号，但核心工作相似：必须足够谨慎地把观察结果与化学计量或校准关系连结起来，才能确保最终所得的浓度确实代表你以为它所代表的意义。