紫外－可见分光光度法：校正与浓度

淡蓝色的水样和较深蓝色的水样都含有相同的铜配合物。哪一个含量较多？

你的眼睛大概会选较深色的溶液。这可以用来做粗略比较，但当颜色差异很小、光照条件改变，或你需要的是实际浓度，而不是「这个看起来比较蓝」时，这种方法就不可靠了。

紫外－可见分光光度法（UV-visible spectrophotometry）以测量取代肉眼判断。它会提出两个很有用的问题：样品会吸收哪些波长的光，以及吸收得有多强？ 第一个问题可以帮助鉴定有色物种，第二个则可以用来测定该物种的含量。

重点不是死记「吸光度与浓度成正比」，而是理解为什么校正会有效、它何时会失效，以及一个吸光度数值实际上告诉你什么。

01先从光发生了什么开始

想像一束光穿过有色溶液。

一部分光进入样品，其中一些被溶液中的物种吸收，其余的光则穿出样品并到达侦测器。

把入射光的强度称为 \(I_0\)，穿过样品后的透射光强度称为 \(I\)。

如果几乎所有光都能穿过，表示样品吸收的光很少。如果只有一小部分光能通过，表示样品有强烈吸收。

在继续之前，先预测一下：如果在其他条件都不变的情况下，把某吸光物种的浓度加倍，会发生什么事？

此时光束路径上大约会有两倍数量的吸光粒子，因此你会预期更多光被吸收。这个直觉是正确的，但要实际运用这种关系，最方便的是使用一个称为吸光度的量。

02透射率与吸光度

透射率 \(T\) 是穿过样品的入射光比例：

\[ T=\frac{I}{I_0} \]

例如，如果有 40% 的入射光被透射，

\[ T=0.40 \]

吸光度 \(A\) 定义为

\[ A=-\log_{10}(T) \]

或等价地，

\[ A=\log_{10}\left(\frac{I_0}{I}\right) \]

吸光度没有单位。

这个对数看起来可能像是不必要的复杂化，但它很有用，因为在适当条件下，吸光度与浓度之间有简单的关系。

假设有 10% 的光被透射：

\[ A=-\log_{10}(0.10)=1.00 \]

如果只有 1% 被透射：

\[ A=-\log_{10}(0.01)=2.00 \]

因此，吸光度为 2 并不表示被吸收的光量是吸光度为 1 时的两倍。其背后的光强关系是对数关系。

这是一个常见陷阱。吸光度是用来进行浓度测量的方便尺度；它本身并不是「被吸收的百分比」。

03为什么不同物质会吸收不同波长

白光包含一系列不同波长。有色物种不会以相同程度吸收所有波长。

其中的电子可以吸收能量恰好符合允许电子能阶变化的光子。由于光子能量取决于波长，

\[ E=\frac{hc}{\lambda} \]

其中：

• \(E\) 是光子能量，单位为焦耳，
• \(h\) 是普朗克常数，
• \(c\) 是光速，单位为米每秒，
• \(\lambda\) 是波长，单位为米。

因此，不同物种通常会在紫外与可见光区域产生不同的吸光模式。

紫外－可见分光光度计可以扫描不同波长，并产生一条吸收光谱：以波长为横轴、吸光度为纵轴作图。

吸光度最大的波长称为 \(\lambda_{\text{max}}\)。

为什么要在 \(\lambda_{\text{max}}\) 附近测量？

假设某物种在 500 nm 的吸收很弱，但在 620 nm 的吸收很强。浓度出现同样的小幅变化时，在 620 nm 测得的吸光度变化会更大。

这会使测量更灵敏。

还有另一个实际优点。在一个宽广吸收峰的顶部附近，微小的波长误差通常不会像位于吸收峰陡峭侧边时那样，造成较大的吸光度变化。

因此，在定量分析中，通常会选择接近 \(\lambda_{\text{max}}\) 的合适波长。

04看到的颜色与被吸收的颜色并不相同

蓝色溶液看起来是蓝色，是因为蓝色波长的光到达了你的眼睛。它通常是在可见光谱的另一个区域吸收得更强。

所以不要这样推理：

「溶液是蓝色，因此它吸收蓝光最强。」

这把过程颠倒了。

你观察到的颜色主要来自穿过溶液的波长，而吸收光谱记录的是从光束中被移除的波长。

粗略的互补色模型可以提供帮助，但真实的光谱通常很宽，而且色彩知觉取决于整个透射光谱。应把互补色的概念视为一个有用的初步模型，而不是精确的鉴定方法。

05使用光谱鉴定物种

假设某未知样品在与已知金属配合物相同的波长附近出现强吸收峰。

这是该配合物可能存在的证据。

但只有一个相符的吸收峰并不能自动构成证明。不同物质的吸收带可能重叠，而混合物也可能产生组合光谱。

如果在相同的相关条件下，整体吸收模式都与参考光谱吻合，鉴定的证据就会更强。

因此，紫外－可见分光光度法有两个彼此相关的用途：

第二个用途需要校正。

06为什么浓度会改变吸光度

把比色皿想像成一条挤满学生的走廊，这些学生一直想和每一个走过的光子击掌。

提高浓度，就像在走廊里放入更多学生。增加光程，就像把走廊加长。无论是哪一种情况，光子都有更多机会被拦截。

这个比喻很有用，因为它表达了为什么浓度和光程都很重要。但它也有局限，因为真正的吸收由量子跃迁控制，而不是光子真的被一群小人伸手抓住。

在适当条件下，这种关系可由比耳－朗伯定律（Beer-Lambert law）描述：

\[ A=\varepsilon bc \]

其中：

• \(A\) 是吸光度，
• \(\varepsilon\) 是摩尔吸光系数，通常以 \(\text{L mol}^{-1}\text{ cm}^{-1}\) 表示，
• \(b\) 是光穿过样品的光程，单位为 cm，
• \(c\) 是浓度，单位为 \(\text{mol L}^{-1}\)。

在固定波长下，对同一物种并使用相同的比色皿光程时，\(\varepsilon\) 和 \(b\) 都是常数。因此，

\[ A\propto c \]

这就是校正图能够成立的原因。

07校正把吸光度转换成浓度

分光光度计直接给你的数值是吸光度。它并不会神奇地知道未知溶液的浓度。

你必须先建立两者之间的关系。

配制数个浓度已知的标准溶液。在相同条件下测量它们的吸光度，再把吸光度对浓度作图。

例如：

这些数值非常接近一条直线。

最佳拟合直线可以表示为

\[ A=1.25\times10^4 c \]

其中 \(c\) 的单位为 \(\text{mol L}^{-1}\)。

现在，就可以把未知样品的吸光度转换成浓度。

如果你想特别练习校正曲线和浓度计算，tutorgum 的 比色法指南 更详细地说明了相同的核心关系。

范例：由吸光度求浓度

某有色配合物的校正关系为

\[ A=8.40\times10^3c \]

其中 \(c\) 的单位为 \(\text{mol L}^{-1}\)。未知溶液在校正所使用的波长下测得吸光度为 0.462。求其浓度。

步骤 1：理解校正方程式的意义。

测得的吸光度 \(A\) 与浓度 \(c\) 有关。我们已知 \(A=0.462\)。

步骤 2：代入测得的吸光度。

\[ 0.462=(8.40\times10^3)c \]

步骤 3：重新整理方程式，求浓度。

\[ c=\frac{0.462}{8.40\times10^3} =5.50\times10^{-5}\text{ mol L}^{-1} \]

因此浓度为

\[ \boxed{5.50\times10^{-5}\text{ mol L}^{-1}} \]

这个结果表示，在与标准溶液相同的实验条件下，未知样品具有预期会产生 0.462 吸光度的浓度。

最后这句话很重要。

08未知样品与标准溶液必须具有可比性

只有在标准溶液与未知样品受到公平比较时，校正才有意义。

以下条件应保持一致：

• 使用的波长，
• 吸光物种的化学形态，
• 溶剂以及相关溶液条件，例如 pH，
• 比色皿的光程，
• 仪器设定，
• 以及在可行情况下相同的配制程序。

想像你用一个宽 1 cm 的玻璃杯校正果汁饮料的颜色，然后用一个宽 4 cm 的玻璃杯测量未知样品。第二个样品让光在溶液中走过长得多的路径。较大的吸光度不一定代表较高的浓度。

这就是为什么标准比色皿具有固定光程，常见的是 1 cm。

09空白样品实际上有什么作用

即使一个溶液完全不含待测物，也可能吸收或散射少量光。

溶剂会吸收一些辐射。试剂也可能吸光。比色皿本身也会影响光束。

空白样品包含那些不应归因于待测物的成分。它用来建立仪器的基线。

假设你的待测物溶于水中，而且每一个标准溶液和样品都加入了另一种试剂。合适的空白样品通常应包含水和该试剂，但不含要测量的待测物。

可以把它想成：在尝试听清楚某一个人的声音之前，先测量背景噪音。

但如果你想像分光光度计会从每个样品中直接减去一个固定量的「颜色」，这个比喻就失效了。仪器真正做的是建立透射光强度的参考，而实际程序会因仪器而异。

10校正曲线是实测关系，不是装饰性的直线

在理想的比耳－朗伯行为下，吸光度对浓度的图会呈线性。

真实数据通常会因测量不确定度而有轻微散布。因此，应使用最佳拟合直线，而不是把每个数据点逐点连线。

校正方程式可以包含截距：

\[ A=mc+b \]

其中：

• \(A\) 是吸光度，
• \(c\) 是浓度，
• \(m\) 是斜率或灵敏度，
• \(b\) 是 \(A\) 轴截距。

在具有完美空白校正的简单理想模型中，\(b\) 会是零。真实实验数据则可能出现一个小的非零截距。

除非有合理依据，否则不要自动强迫直线通过原点。

11内插比外推更安全

假设你的标准溶液涵盖的吸光度范围是 0.10 至 0.75，但未知样品得到 \(A=1.18\)。

你可能会想把直线延伸出去，照样计算浓度。

问题在于，你并没有证明校正在这个更高浓度下仍然有效。比耳－朗伯行为可能偏离线性，而且当到达侦测器的光非常少时，仪器表现也可能变得较不可靠。

通常更好的做法是先稀释未知样品，直到它的吸光度落在校正范围内，再求出稀释后的浓度，最后以数学方式反推原始浓度。

范例：稀释后测量未知样品

某离子在 525 nm 下的校正关系为

\[ A=(2.60\times10^3)c+0.006 \]

其中 \(c\) 的单位为 \(\text{mol L}^{-1}\)。

某未知溶液最初的吸光度高于已校正的范围。取其中 10.00 mL，稀释至 50.00 mL。稀释后的溶液吸光度为 0.552。

求原溶液的浓度。

步骤 1：利用校正方程式求稀释后溶液的浓度。

\[ 0.552=(2.60\times10^3)c+0.006 \]

\[ 0.546=(2.60\times10^3)c \]

\[ c=\frac{0.546}{2.60\times10^3} =2.10\times10^{-4}\text{ mol L}^{-1} \]

这是稀释后的浓度。

步骤 2：计算稀释倍数。

将 10.00 mL 稀释至 50.00 mL：

\[ \text{稀释倍数}=\frac{50.00}{10.00}=5.000 \]

步骤 3：求回原始浓度。

\[ c_{\text{原液}} =(2.10\times10^{-4})(5.000) =1.05\times10^{-3}\text{ mol L}^{-1} \]

所以原始浓度为

\[ \boxed{1.05\times10^{-3}\text{ mol L}^{-1}} \]

稀释并没有从所取出的 10.00 mL 样品中移除待测物。它只是增加了体积，因此降低了浓度。一旦测得稀释后的浓度，就可以利用稀释倍数重建原始数值。

12最容易产生的误解：颜色越深一定代表浓度越高

对于含有相同吸光物种的两个溶液，如果在相同条件下、以适当波长测量，那么在有效线性范围内，较大的吸光度通常表示较高的浓度。

但「颜色越深就代表浓度越高」并不是普遍定律。

一个看起来更深色的溶液可能涉及：

• 不同的化学物种，
• 不同的光程，
• 不同的波长分布，
• 多种吸光物种，
• pH 改变导致物种转变成不同形态，
• 或浓度已超出可靠的校正范围。

紫外－可见分析之所以有效，是因为实验条件受到控制。单靠颜色并不足够。

这在环境分析中特别重要，因为样品中的其他物种可能造成干扰。如何把分析测量转化为站得住脚的结论这个更广泛的问题，在 tutorgum 的 环境化学监测指南 中有更深入的说明。

13哪些因素会使比耳－朗伯行为失效？

简洁的式子 \(A=\varepsilon bc\) 是有适用条件的。

浓度非常高的溶液

在较高浓度下，粒子之间的相互作用可能改变其吸光行为。简单的正比关系可能不再能很好成立。

样品中的化学变化

假设某物质会依 pH 以两种不同形式存在，而且这两种形式具有不同的吸收光谱。

这时改变 pH 所改变的不只是浓度，也会改变存在哪些物种。

在某一 pH 下建立的校正，可能无法正确描述另一个 pH 下的未知样品。

杂散光与仪器限制

如果吸光度极高，真正应该到达侦测器的光会非常少。此时，即使只有少量杂散光，相对于透射光束也可能变得显著。

散射

悬浮粒子可能把光散射，使其无法到达侦测器。仪器可能把部分这种光损失解读为吸收，导致测得的吸光度过高。

这就是为什么遇到混浊样品时应提高警觉。

14一个实用的判断流程

在 HSC 类型的题目中遇到紫外－可见数据时，可以依照以下顺序思考：

1. 确认所测量的波长和物种。 问自己：这个测量对目标待测物是否具有足够选择性？
2. 检查校正范围。 未知样品理想上应落在标准溶液所建立的范围内。
3. 使用校正方程式或图表。 如果 \(A=mc+b\)，则重新整理为 \(c=(A-b)/m\)。
4. 考虑任何稀释。 分光光度计测量的是实际放入比色皿中的溶液，而不是它在稀释前的浓度。
5. 检查单位。 只有在需要时，才在 \(\text{mol L}^{-1}\)、\(\text{g L}^{-1}\) 或 \(\text{mg L}^{-1}\) 之间换算。
6. 判断校正在化学上是否有效。 不同的 pH、物种、样品基质或过高的吸光度，都可能让一个数值上看似漂亮的答案失去可靠性。

计算机可以处理第 3 步。大部分真正的化学思考其实藏在第 1、2 和 6 步。

15问题与解答

问题 1

一个含有有色金属配合物的溶液，在其 \(\lambda_{\text{max}}\) 下测量。其校正方程式为

\[ A=(4.80\times10^3)c+0.004 \]

其中 \(c\) 的单位为 \(\text{mol L}^{-1}\)。

某未知样品的吸光度为 0.388。计算其浓度。

解答 1

浓度为 \(\boxed{8.00\times10^{-5}\text{ mol L}^{-1}}\)。

校正方程式直接把吸光度与浓度联系起来：

\[ A=(4.80\times10^3)c+0.004 \]

代入 \(A=0.388\)：

\[ \begin{aligned} 0.388&=(4.80\times10^3)c+0.004\\ 0.384&=(4.80\times10^3)c\\ c&=\frac{0.384}{4.80\times10^3}\\ &=8.00\times10^{-5}\text{ mol L}^{-1} \end{aligned} \]

这个小截距必须纳入计算。一个很容易采用的捷径是使用 \(A=mc\) 并忽略 0.004，但题目提供的校正告诉我们，实际测得的关系具有非零截距。

问题 2

一个含有有色离子的水样，其吸光度为 1.36。分析所使用的校正标准溶液吸光度范围为 0.08 至 0.82。

一名学生把 \(A=1.36\) 直接代入线性校正方程式，并报告所得的浓度。

解释为什么这个结果不如先稀释样品再重新测量所得的结果可靠。并说明稀释后应如何求出最终浓度。

解答 2

应把样品稀释至其测得吸光度落在已建立的校正范围内，然后把计算所得的稀释后浓度乘以适当的稀释倍数。

学生的计算属于外推。标准溶液只在实际测量的范围内建立了浓度与吸光度之间的关系，也就是对应吸光度 0.08 至 0.82 的范围。

在 \(A=1.36\) 处使用同一条直线，等于假设相同的线性关系会延续到远超出实验证据的区域。这可能不成立，因为高浓度溶液可能偏离理想的比耳－朗伯行为，而且高吸收样品只会透射非常少的光，使仪器效应变得更加重要。

稀释后：

1. 测量稀释样品在校正范围内的吸光度；
2. 使用校正方程式求出 \(c_{\text{稀释后}}\)；
3. 求稀释倍数，

\[ \text{稀释倍数}= \frac{V_{\text{最终}}}{V_{\text{分取}}}; \]

1. 计算

\[ c_{\text{原液}} =c_{\text{稀释后}} \times \frac{V_{\text{最终}}}{V_{\text{分取}}}. \]

一个很诱人的论点是：既然校正线是直线，就可以把它无限延长。问题并不在代数，而在实验：在校正区域之外，线性关系并没有被证实。

问题 3

一种有色物种 \(X\) 使用在 pH 10 下配制的标准溶液进行分析。它在 610 nm 下的校正方程式为

\[ A=(6.20\times10^3)c+0.003 \]

其中 \(c\) 的单位为 \(\text{mol L}^{-1}\)。

一个 pH 5 的未知样品给出 \(A=0.499\)。一名学生计算

\[ c=\frac{0.499-0.003}{6.20\times10^3} =8.00\times10^{-5}\text{ mol L}^{-1}. \]

之后发现 \(X\) 会发生酸碱反应，而且其酸性形式的吸收光谱与碱性形式不同。

评估学生所求得的浓度。

解答 3

就校正方程式而言，数值计算是正确的，但在没有进一步资讯的情况下，\(\boxed{8.00\times10^{-5}\text{ mol L}^{-1}}\) 不能被视为总 \(X\) 的可靠浓度。

学生正确地进行了以下计算：

\[ \begin{aligned} c&=\frac{A-b}{m}\\ &=\frac{0.499-0.003}{6.20\times10^3}\\ &=8.00\times10^{-5}\text{ mol L}^{-1}. \end{aligned} \]

问题出在校正背后的化学。

标准溶液是在 pH 10 下配制，但未知样品的 pH 为 5。如果 \(X\) 的质子化状态会随 pH 改变，而且其酸性与碱性形式具有不同的吸收光谱，那么在 610 nm 下，标准溶液与未知样品的摩尔吸光系数 \(\varepsilon\) 不一定相同。

因此，在套用校正关系

\[ A=\varepsilon bc \]

时，实际上可能使用了不同的 \(\varepsilon\) 值。

一个很诱人的结论是，只要把吸光度对应到校正线，就一定能得到浓度。这只有在未知样品的光谱行为与标准溶液相同时才成立。应把样品调整至与标准溶液相同且受控制的化学条件，或使用能重现样品条件的标准溶液进行校正。

问题 4

五个标准溶液在 540 nm 下得到以下结果。

这个关系具有高度线性。

一名学生说：

「因为图是直线，所以实验完美符合比耳－朗伯定律，因此空白样品一定配制正确。」

零浓度标准溶液使用了与其他溶液相同的溶剂，但不小心漏加了一种显色试剂；这种试剂在所有非零浓度标准溶液和所有未知样品中都以固定浓度存在。

评估学生的结论。预测如果使用被强迫通过原点的校正线，这个错误可能如何影响所计算的浓度。

解答 4

学生的结论不正确。直线只表示响应具有高度线性，但待测物浓度为零时仍有很大的吸光度，显示存在显著的背景贡献，而错误配制的空白样品并没有重现这个背景。

在待测物浓度为零时，测得的吸光度为 0.081，而不是接近零。重要线索在于，每个实际样品都含有空白样品所缺少的显色试剂。

每当待测物浓度增加 \(1.00\times10^{-5}\text{ mol L}^{-1}\)，标准溶液的吸光度约增加 \(0.060\)。因此，一个合理的实测关系大约为

\[ A\approx(6.0\times10^3)c+0.081. \]

非零截距并不表示当 \(c=0\) 时 somehow 还存在某种浓度。它表示实际测得了背景吸光度。

如果学生错误地强迫校正线通过原点，一部分背景吸光度就会被归因于待测物。因此，计算所得的浓度一般会偏高，特别是在待测物浓度较低时，因为此时 0.081 占总吸光度的比例很大。

例如，一个 \(A=0.201\) 的样品，使用实测关系可得

\[ \begin{aligned} 0.201&=(6.0\times10^3)c+0.081\\ c&=\frac{0.120}{6.0\times10^3}\\ &=2.0\times10^{-5}\text{ mol L}^{-1}. \end{aligned} \]

如果把 0.201 的全部吸光度都当作待测物的响应，浓度就会被高估。

一个很诱人的思路是把「图是直线」等同于「实验完美」。线性只告诉我们一个变数会随另一个变数以可预测的方式变化。系统误差本身也可以非常一致，因而产生一条非常漂亮、却具有误导性的直线校正。

问题 5

两种有色物种 \(X\) 和 \(Y\) 可以同时存在于同一溶液中。它们的吸收带彼此重叠。

校正实验显示，在固定条件下并使用相同的 1.00 cm 比色皿时，它们对吸光度的贡献如下：

假设比耳－朗伯行为为线性，而且当 \(X\) 和 \(Y\) 混合时，它们对吸光度的贡献可以相加。

某未知混合物得到：

\[ A_{450}=0.440 \]

以及

\[ A_{600}=0.380. \]

一名学生注意到 \(X\) 在 450 nm 的吸收比 \(Y\) 强得多，因此认为可以把 450 nm 的测量视为只有 \(X\) 存在。

求 \(X\) 和 \(Y\) 的浓度，并解释为什么学生这个看似合理的捷径会失败。

解答 5

混合物含有

\[ \boxed{[X]=6.50\times10^{-5}\text{ mol L}^{-1}} \]

以及

\[ \boxed{[Y]=5.00\times10^{-5}\text{ mol L}^{-1}}. \]

关键在于，「吸收得更强」并不表示「只有它会吸收」。物种 \(Y\) 在 450 nm 仍会对吸光度有所贡献，而 \(X\) 在 600 nm 也会有所贡献。

令

\[ x=\frac{[X]}{1.00\times10^{-4}\text{ mol L}^{-1}} \]

以及

\[ y=\frac{[Y]}{1.00\times10^{-4}\text{ mol L}^{-1}}. \]

由于假设吸光度可以相加，450 nm 的测量给出

\[ 0.600x+0.100y=0.440. \]

600 nm 的测量给出

\[ 0.200x+0.500y=0.380. \]

把第二个方程式乘以 3：

\[ 0.600x+1.500y=1.140. \]

减去第一个方程式：

\[ 1.400y=0.700 \]

因此

\[ y=0.500. \]

所以，

\[ [Y]=(0.500)(1.00\times10^{-4}) =5.00\times10^{-5}\text{ mol L}^{-1}. \]

把 \(y=0.500\) 代入第一个方程式：

\[ \begin{aligned} 0.600x+0.100(0.500)&=0.440\\ 0.600x+0.050&=0.440\\ 0.600x&=0.390\\ x&=0.650. \end{aligned} \]

因此，

\[ [X]=(0.650)(1.00\times10^{-4}) =6.50\times10^{-5}\text{ mol L}^{-1}. \]

现在来看那个很诱人的捷径。如果学生假装 450 nm 的全部吸光度都来自 \(X\)，就会计算

\[ x=\frac{0.440}{0.600}=0.733, \]

得到

\[ [X]=7.33\times10^{-5}\text{ mol L}^{-1}. \]

这个数值偏高，因为实际混合物中有一部分测得的吸光度–0.050 个吸光度单位–来自 \(Y\)。

更深一层的重点是，仪器测量的是光束所受到的总效果。它不会把个别被吸收的光子标记成「由 \(X\) 造成」或「由 \(Y\) 造成」。选择性来自不同波长上的整体模式。当光谱重叠时，在多个波长进行测量，有时可以分离单一波长无法区分的不同贡献。

16紫外－可见分光光度法接下来能让你做什么

现在，核心推理链是：

\[ \text{物种} \rightarrow \text{随波长变化的吸收} \rightarrow \text{吸光度} \rightarrow \text{校正} \rightarrow \text{浓度}. \]

在鉴定方面，要看吸收发生在哪里，并理解光谱吻合是一种证据，而不是自动构成证明。

在定量方面，要控制化学条件、在合适波长测量、使用已知标准溶液建立校正、让未知样品保持在已验证的范围内，并把任何稀释因素纳入考虑。

同样的推理方式也延伸到真实的分析化学中。下一个真正有用的问题不再只是「我算出的浓度是多少？」而是「这个测量是否真的代表了我以为自己正在测量的那个物种？」到了这一步，干扰、样品制备、不确定度，以及分析证据的品质，就会变得和校正方程式一样重要。